О проведении тестирования диагностических наборов (ZETECT Rapid test Kit прозводитель Bionote Inc.)

Введение

Инфекционные болезни свиней наносят большой экономический ущерб свиноводству, особенно при промышленном ведении этой отрасли, а наибольший уровень падежа животных до 70%, приходится на первую неделю их жизни. В свою очередь наибольшую заболеваемость и гибель поросят в подсосный период вызывает диарейный синдром. Диареи у поросят вызывают различные по природе этиологические агенты: вирусы (трансмиссивный гастроэнтерит, эпидемическая диарея, рота- и энтеровирусные инфекции), бактерии (Escherichia coli, клостридии, сальмонеллы и др.), простейшие (кокцидии, балантидии и др.), гельминты (эзофагостомоз, стронгилоидоз, трихоцефалез и др.) [1,2,6,7,8]. Кроме того, значительная часть кишечных заболеваний вызвана ошибками в кормлении и не соблюдении правил гигиены при содержании и уходе за животными.

Так, немецкие исследователи [9] при анализе заболеваемости поросят-сосунов и отъемышей с диарейным синдромом на 24 фермах юга Германии в 66,7% ферм выделили коронавирусы, в 62,5% — Isospora suis, в 58,3% -E. сoli, в 20,8% ферм — ротавирусы, менее 10% приходилось на эймерии, криптоспоридии и балантидии. Коронавирусы выделяли только от поросят 15–21 и 36-42-дневного возраста, при этом позитивными являлись всего 13,4% животных от общего количества исследованных. Согласно высказыванию других немецких исследователей [8], колибактериоз — это наиболее часто встречаемая болезнь поросят-сосунов.

Исследования, проведенные в ФГУ «ВНИИЗЖ» в течение 1997—2011 гг., показывают, что в отечественных свиноводческих хозяйствах ведущая роль в кишечной патологии принадлежит энтеротоксигенной кишечной палочке (до 50% положительных проб из общего количества исследованных) и возбудителю анаэробной энтеротоксемии — Clostridium perfringens типы, А и С (до 45% положительных проб). На долю возбудителя дизентерии (Serpulina hyodysenteriae) и сальмонеллеза приходилось до 10% положительных проб, ротавируса — 6% и вируса эпидемической диареи — 14%. Проведенные исследования позволили также установить, что за последние несколько лет возбудителей трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГС) в пробах патологического материала ни разу не выявляли [1,3,4,5]. Однако было несколько случаев обнаружения вакцинных штаммов вируса ТГЭС в пробах из хозяйств, где применяли для профилактики ТГЭС живую вакцину.

Также за последнее десятилетие в ФГУ «ВНИИЗЖ» на наличие антител к вирусу ТГЭС было исследовано более десяти тысяч проб сывороток крови, полученных от свиней из различных хозяйств России, в т. ч. из свиноферм, проводящих вакцинацию против ТГЭС и ферм, не вакцинирующих против этого заболевания. В результате исследования в реакции микронейтрализации (РМН) сывороток крови, полученных от вакцинированных животных, было установлено наличие антител в большинстве проб. При исследовании сывороток крови, полученных от свиней в хозяйствах, где не проводилась вакцинация, антитела к вирусу ТГЭС не выявлены [4]. Указанные исследования также косвенно подтверждают благополучие свинохозяйств России по ТГС.

Материалы и методы

Поскольку исходя из вышеизложенного, не представлялось возможным в условиях неблагополучного по ТГС хозяйства провести полевые испытания на выявления антигена указанного вируса, для тестирования набора (ZETECT Rapid test Kit прозводитель Bionote) использовали известные российские штаммы вируса ТГС: Краснодонский», выделен в 1998 г. из кишечника больных поросят, принадлежащих ЗАО «Краснодонское» Волгоградской области, «Ленинградский» — в 1995 г., из внутренних органов поросят-сосунов, принадлежащих ГПЗ «Восточный» Ленинградской области. Серийными пассажами они были выделены на первичной культуре клеток почки свиньи (СП) и адаптированы к перевиваемой культуре клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ). При исследовании их методом ПЦР в пробах подтверждено наличие только геномной РНК вируса ТГС. Сравнительный анализ нуклеотидной последовательности их генов, показал, что эти штаммы существенно отличаются между собой. Инфекционный титр штаммов «Краснодонский» и «Ленинградский» составляет 8,5 lg тцд/50 см³. В то же время, оба штамма авирулентны для безмолозивных поросят.

Для тестирования наборов по выявлению антигена эпизоотической диареи свиней использовалось содержимое кишечника больных поросят из неблагополучного по данному заболеванию свинохозяйства Липецкой обл. (диагноз подтвержден лабораторными исследованиями в ФГУ «ВНИИЗЖ» от 08.08.2011 г.).

Для тестирования наборов по выявлению антигена ротавируса использовалось содержимое кишечника больных поросят из неблагополучного по данному заболеванию свинохозяйства Новгородской обл. (диагноз подтвержден лабораторными исследованиями в ФГУ «ВНИИЗЖ» от 22.07.2011 г.). Также в наших испытаниях был использован и культуральный ротавирус свиней шт. «КД — 47» 2-ого пассажа от 27.07.2011 г. с титром 3.5 lg тцд/50 см³ на культуре клеток СПЭВ (перевиваемая почка эмбриона свиней).

Результаты исследований

Поскольку, в инструкции по применению набора ZETECT Rapid test Kit прозводитель Bionote, Inc., TGE/PED Ag имеется указание, о его высокой чувствительности, для испытания были приготовлены разведения исходного вируссодержащего материала вируса ТГС штаммы «Краснодонский» и «Ленинградский» с исходным титром 8.5lg тцд/50 см³, от 10–1 до 10–4. Каждое из разведений вируса вносили в обе лунки (ТГС и ЭДС) одного диагностического планшета. Результаты испытаний по выявлению антигена вируса ТГС представлены в таблице 1.

Таблица №1

Штаммы вируса ТГС Рабочие разведения вируссодержащего материала
10-1 10-2 10-3 10-4
Краснодонский + + - -
Ленинградский + + - -

Представленные в табл. 1 данные свидетельствуют, что в испытуемом тесте положительно среагировал материал обоих штаммов вируса ТГС в разведении 10-1 и 10-2 (учет реакции через 10 минут после постановки) (рис. 1). Разведения 10-3 и 10-4 при тестировании были отрицательными (отсутствие диагностической полоски, при хорошо заметной контрольной полоске).

1213.jpg

Рис. 1

Одновременно с испытанием чувствительности данного теста по выявлению антигена вируса ТГС, проводилась и оценка его специфичности, по отсутствию ложноположительных реакций в окошке выявления антигена вируса эпизоотической диареи свиней (ЭДС). Как видно на рис. 1, такого явления обнаружено не было.

На следующем этапе испытаний использовали диагностические планшеты по выявлению антигенов вируса эпизоотической диареи и ротавируса свиней ZETECT Rapid test Kit прозводитель Bionote, Inc., PED/Rota Ag.

Из патматериала от больных эпизоотической диареей поросят была сделана суспензия. Далее в соответствии с Инструкцией по применению посредством прилагаемых в наборе отборников (на конце палочки с ватным тампоном) суспезию патматериала вносили во флакончики с растворителем, откуда в обе лунки диагностического планшета ЭДС/Рота. Положительный результат теста (выявился через 15 минут после постановки) по обнаружению антигена вируса ЭДС зафиксирован на рис. 2.

12132.jpg

Рис. 2

Однако результат тестирования патматериала от поросят больных ротавирусной инфекцией (выполнен аналогично вышеописанной методике) оказался отрицательным рис. 3.

12132.jpg

Рис. 3

Культуральный ротавирус штамма «КД — 47» с титром 3.5lg Бтцд/50 см³ был внесен в лунки 2 разных планшетов в цельном виде и в разведении 10-1. Через 20–25 минут на планшете, куда вносили неразведенный ротавирус, помимо контрольной полоски была хорошо заметна и диагностическая полоска (рис. 4).

12133.jpg

Рис. 4

Из рис. 4 видно, что в окошке обнаружения антигена вируса ЭДС имеется только контрольная полоса, что подтверждает специфичность теста.

Таким образом, при испытании ZETECT Rapid test Kit, Bionote Inc. для выявления антигенов вируса трансмиссивного гастроэнтерита / эпизоотической диареи свиней (TGE/PED Ag) установлено, что с его помощью можно обнаружить антиген отличающихся друг от друга культуральных штаммов вируса ТГС «Краснодонский» и «Ленинградский» на уровне 6,5 lg тцд/50 см³. При этом не отмечено ложноположительного результата по выявлению антигена вируса ЭДС.

При испытании ZETECT Rapid test Kit, Bionote Inc. для выявления антигенов вируса эпизоотической диареи / ротавируса свиней (PED/Rota Ag) установлено, что с его помощью удалось выявить антиген вируса ЭДС в патматериале от больных поросят и культуральный ротавирус штамм «КД — 47» с титром 3.5lg тцд/50 см³.

Заключение

Опыт работы с наборами указывает, что использовать их в полевых условиях достаточно удобно, однако получаемые результаты (особенно отрицательные) правильно будет рассматривать как «быструю оценку», требующую подтверждения соответствующими методами лабораторной диагностики.

Список литературы:

  1. Кукушкин С. А. Профилактика диарейных болезней поросят в подсосный период // Промышленное и племенное свиноводство.-2007,№ 2.-С.55–57.
  2. Заболевания свиней / Э.-Г. Гельвиг; Пер. с нем.-М.:ООО «Издательство Астрель»:ООО «Издательство АСТ»,2003.-112с.
  3. Ковалишин В.Ф., Щербаков А.В., Каньшина А.В. и др. Новые подходы в диагностике болезней свиней и их практическая значимость //Ветеринарна бiотехнологiя.-2006,№ 9.-Киев.-С.121–131.
  4. Кукушкин С.А., Байбиков Т.З., Пузанкова О.С. и др. Значение мониторинга инфекционных болезней в промышленном свиноводстве // Ветеринарна бiотехнологiя.-2006,№ 9.-Киев.-С.161–169.
  5. Щербаков А.В., Ковалишин В.Ф., Яковлева А.С., Шабаева Г. В. Этиологическая структура инфекционных болезней свиней в животноводческих хозяйствах России // Актуальные проблемы инфекционной патологии животных: Матер. Межд. науч.-практ. конф., посвящ. 45-летию ФГУ «ВНИИЗЖ».-Владимир,2003.-С.146–150.
  6. Cooper v. L. Diagnosis of neonatal pig diarrhea // Veterinary clinics of North America: Food animal practice.-2000.-v. 16,№ 1.-P.117–133.
  7. Done S. H. Rotavirus in pigs // The Pig Journal.-2000,№ 46.-P.150–162.
  8. Eich K.-O., Schmidt U. / Handbuch Schweinekrankheiten.-Munster-Hiltrup,1998.
  9. Wieler L.N., Ilieff A., Herbst W. et al. Prevalence of enteropathogens in sucklinf and weaned piglets with diarrhoea in Southern Germany // J.Vet. Med.-2001.-Bd.48.-S.151–159.

Ваш регион?

Федеральный округ:

Центральный ФО
Приволжский ФО
Сибирский ФО
Южный ФО
Северо-Западный ФО
Дальневосточный ФО
Крымский ФО
Северо-Кавказский ФО
Уральский ФО
Белгородская область
Брянская область
Владимирская область
Воронежская область
Ивановская область
Калужская область
Костромская область
Курская область
Липецкая область
Московская область
Орловская область
Рязанская область
Смоленская область
Тамбовская область
Тверская область
Тульская область
Ярославская область
Москва
Республика Башкортостан
Республика Марий Эл
Республика Мордовия
Республика Татарстан
Удмуртская Республика
Чувашская Республика
Кировская область
Нижегородская область
Оренбургская область
Пензенская область
Ульяновская область
Самарская область
Саратовская область
Пермский край
Республика Алтай
Республика Бурятия
Республика Тыва
Республика Хакасия
Алтайский край
Забайкальский край
Красноярский край
Иркутская область
Кемеровская область
Новосибирская область
Омская область
Томская область
Республика Адыгея
Республика Калмыкия
Краснодарский край
Астраханская область
Волгоградская область
Ростовская область
Республика Карелия
Республика Коми
Архангельская область
Вологодская область
Калининградская область
Ленинградская область
Мурманская область
Новгородская область
Псковская область
Город федерального значения Санкт-Петербург
Ненецкий автономный округ
Республика Саха (Якутия)
Камчатский край
Приморский край
Хабаровский край
Амурская область
Магаданская область
Сахалинская область
Еврейская автономная область
Чукотский автономный округ
Республика Крым
Город федерального значения Севастополь
Республика Дагестан
Республика Ингушетия
Кабардино-Балкарская Республика
Карачаево-Черкесская Республика
Республика Северная Осетия
Чеченская республика
Ставропольский край
Курганская область
Свердловская область
Тюменская область
Челябинская область
Ханты-Мансийский автономный округ — Югра
Ямало-Ненецкий автономный округ
Яндекс.Метрика