О проведении в полевых условиях тестирования диагностического набора (ZETECT PRRS, BIONOTE) для выявления антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС)

Введение

Для обнаружения антител к вирусу репродуктивно респираторного синдрома свиней (РРСС) могут быть использованы различные методы. Цели серологического обследования различаются. Например, оно используется для I) диагностики заболевания, 2) выявления распространения инфекции, 3) косвенной оценки эффективности проводимой вакцинации, 4) попыток установить или подтвердить, что животные являются свободными от заболевания и 5) оценке эффективности мероприятий по изменениям условий содержания животных на ферме.

Поэтому для некоторых задач достаточным бывает получение качественных данных (положительный/отрицательный), а в других случаях необходимыми являются количественные или полуколичественные данные.

Интерпретация полученных с помощью ИФА (иммуноферментный анализ) соотношений S/P (отношение значения оптической плотности образца к значению оптической плотности стандартного контроля) для парных образцов является менее однозначной, чем для методов РН (нейтрализация) или РИФ (иммунофлуоресцентных антител). В методах РН и РИФ используют титрование (тестируются многократные серийные разведения образца сыворотки) для достижения линейной количественной конечной точки для концентрации антител к ВРРСС.

Метод ИФА получивший наибольшее распространение из-за доступности коммерческих наборов, делающих постановку реакции простой, быстрой, массовой, иногда используется и для получения количественных результатов, но он не слишком хорош для выявления титра антител в сыворотке. Фактически соотношение S/P не линейно зависит от относительной концентрации антител, как это можно определить с помощью других методов (Mengeling & Lager, 2000).

С помощью ИФА антитела к ВРРСС обнаруживаются уже через несколько дней после первоначальной инфекции или вакцинации. Эти антитела не являются нейтрализующими, поскольку нейтрализующие антитела обнаруживаются только через несколько недель после инфекции. Уровень обнаруживаемых с помощью ИФА антител к ВРРСС снижается до «отрицательных» значений примерно через 4 — 6 месяцев после первоначального пика. Означает ли это, что свиноматки становятся сероотрицательными через несколько месяцев после вспышки, возможно теряя свой иммунитет и вновь становясь восприичивыми? Напротив, при применении других серологических методов выявления антител (РН) они обнаруживаются даже спустя год после первоначального инфицирования.

В тоже время, в реакции нейтрализации выявляются именно вируснейтрализующие антитела, но срок их обнаружения не ранее, чем через 36-90 дней после инфицирования/прививки (I.J. Yoon et al., 1994; O.J. Lopez et al., 2007).

В РМН выявляют вируснейтрализующие антитела к вирусу РРСС у естественно инфицированных животных в невысоких титрах: 1 log2, 2-3 log2 и ≥4,0 log2. В то же время принято считать, что животные являются защищенными от виремии при наличии в их сыворотках крови вируснейтрализующих антител в титрах не ниже 3,0 log2 (I. Diaz, et al., 2006).

Отсутствие антител к PRRSV вероятно является плохим прогностическом фактором касательно того, остаются ли животные иммунными или становятся восприимчивыми. Однако остается фактом, что многократно вакцинированные свиноматки могут быть сероотрицательными (по результатам ИФА), но парадоксальным образом иметь великолепную защиту против заболевания, а нейтрализация ВРРСС у них происходит еще до того, как иммунная система почувствует необходимость продуцирования антител. Распределение отношений S/P при исследованиях с помощью метода ИФА используется для установления инфекционного статуса группы тестируемых свиней. Подсчитывают среднее значение и стандартное отклонение. Среднее значение < 0.4 указывает на отрицательный статус поголовья или, на то, что свиньи были инфицированы давно и не сталкивалось с ВРРСС в течение длительного времени. Такого типа результаты обычно также имеют незначительное стандартное отклонение ( < ± 0.4). Невысокое значение стандартного отклонения указывает на однородность статуса группы в плане инфекции (или иммунности) и его также наблюдают после массовой вспышки заболевания. Большое стандартное отклонение (> ± 0.4 — 0.7) указывает на отсутствие однородности в пределах группы, скорее всего, из-за недавней циркуляции вируса только среди части группы (исходят из того, что большинство контактировавших животных демонстрирует иммунный ответ, обнаруживаемый с помощью метода ИФА). В группах где у большинства животных значения отношения S/P близки 0.4, но у небольшой пропорции животных S/P >1.5 (нестабильный тип распределения), вероятнее всего они контактировали с вирусом впервые (ранее не привитые/инфицированные животных) или возможно, повторно контактировали с вирусом, и у них проявился клеточный иммунный ответ (восприимчивая популяция). Представляется очевидным, что вирус циркулирует в пределах этих групп. Однако, метод ИФА не очень чувствителен для обнаружения клеточного иммунного ответа у подвергшихся повторному контакту животных (как в случае повторно вакцинированных животных) или контактировавших с вирусом ранее вакцинированных животных, и судя по полученному с помощью ИФА серораспространению в инфицированных группах животных можно очень существенно недооценить степень распространения вируса, которая имеет место в данной популяции (M. McCaw, 2001).

Таким образом, обнаружение антител с помощью метода ИФА является свидетельством того, что животное в прошлом контактировало с вирусом. Получаемое в данном случае отношение S/P не является непосредственным отражением содержания антител и представляет собой указание на контакт с вирусом в прошлом.

Иммунный ответ по данным ИФА теряется через 4-6 месяцев после инфекции.

Иммунный ответ по данным ИФА может не определяться в случае многократных вакцинаций.

Отсутствие антител по данным ИФА не коррелирует с отсутствием иммунитета.

Материалы и методы

Диагностические наборы для выявления антител к вирусу РРСС методом иммуноферментного анализа:

  • ZETECT PRRS , BIONOTE;

  • Herd Chek Test Kit IDEXX, USA.

Исследования проводились согласно Инструкциям по применению тест-наборов. Выявление антител к вирусу РРСС также проводили в реакции микронейтрализации с использованием перевиваемой культуры клеток, и вируса РРСС штамма «КПР» с титром 5,0 lg ТЦД50/см3.

Для постановки РМН отбирали планшеты с равномерно выросшим монослоем культуры клетокMARC-145. Из каждой лунки отбирали по 0,1 см3 культуральной среды и, взамен этого, вносили по 0,1 см3 смеси сыворотка-вирус из других планшетов, взятых после 1-часового контакта. Планшеты инкубировали в СО2-инкубаторе при температуре 37оС в течение 72-144 часов.

Микроскопию монослоя клеток в лунках планшетов вели ежедневно в течение 6-7 дней, просматривая их под инвертируемым микроскопом, регистрируя лунки с выраженным ЦПД вируса и/или лунки с цельным неповрежденным монослоем клеток. 149 сывороток крови свиней полученных из различных хозяйств РФ.

Результаты исследований

Проводилось одновременное тестирование сывороток в разных диагностических наборах ИФА, также сыворотки из 2 хозяйств были дополнительно протестированы в РМН. Результаты исследований представлены в таблицах1-3.

Результаты исследования сыворотки крови свиней №1

№ п/п IDEXX (SP/±) ZETECT (SP/±) РМН (log2/±)
1. 0,44 + 2,16 + 2,5 +
2. 0,45 + 0,31 + <1,0 -
3. 2,82 + 0,98 + 5,5 +
4. 0,7 + 0,54 + 3 +
5. 3,59 + 1,16 + 5,5 +
6. 1,41 + 0,93 + 6 +
7. 0,56 + 0,94 + <1,0 -
8. 1,94 + 0,67 + 4,5 +
9. 1,45 + 0,78 + 5,5 +
10. 2,88 + 1,11 + 5,5 +
11. 2,41 + 1,11 + 5,5 +
12. 0,01 - 0,28 - <1,0 -
13. 0,02 - 0,6 + <1,0 -
14. 0,83 + 0,79 + 5,5 +
15. 0,04 - 0,14 - <1,0 -
16. 0,49 + 0,4 + <1,0 -
17. 1,83 + 1,15 + 4,5 +
18. 2,16 + 1,49 + 6 +
19. 1,52 + 0,29 - <1,0 -
20. 1,15 + 0,37 + 4,5 +

ИФА IDEXX
≥0,4 — антитела обнаружены (результат положительный),
<0,3 — антитела не обнаружены (результат отрицательный).

ИФА ZETECT
≥0,3 — антитела обнаружены (результат положительный),
<0,3 — антитела не обнаружены (результат отрицательный).

РМН:
≥1,0 log2 — антитела обнаружены (результат положительный),
<1,0 log2 — антитела не обнаружены (результат отрицательный);

Представленные в табл. 1 данные свидетельствуют, что из 20 исследованных, 17 проб были положительны в обоих ИФА тестах (85%), однако результаты исследований проб № 13 и 19 не совпадали. В РМН положительных проб было всего 13 (65%), что вероятно свидетельствует о относительно недавнем сроке вакцинации/инфицирования стада. Выявить зависимость уровня титров антител в РМН к величине показателей (S/Р) не представлялось корректным из-за полученной разницы в значениях ИФА.

Результаты исследования сыворотки крови свиней №2

№ п/п IDEXX (SP/±) ZETECT (SP/±) РМН (log2/±)
1. 0,4 + 0,19 - <1,0 -
2. 2,25 + 0,63 + 5 +
3. 0,94 + 0,34 + <1,0 -
4. 2,25 + 0,57 + 5,5 +
5. 1,16 + 0,31 + 3,5 +
6. 2,18 + 1,45 + 5,5 +
7. 1,49 + 0,87 + 5,5 +
8. 1,35 + 0,48 + 4,5 +
9. 2,19 + 1,22 + 6,5 +
10. 2,41 + 0,78 + 6,5 +
11. 3,4 + 1,26 + 6,5 +
12. 1,43 + 0,43 + 5,5 +
13. 0,03 - 1,61 + <1,0 -
14. 0,19 - 1,36 + <1,0 -
15. 1,23 + 0,66 + 4,5 +
16. 3,65 + 1,23 + 6,5 +
17. 2,44 + 0,74 + 5,5 +
18. 1,72 + 1,03 + 5,5 +
19. 0,08 - 1,69 + 3,5 +
20. 1,63 + 0,65 + <1,0 -

ИФА IDEXX
≥0,4 — антитела обнаружены (результат положительный),
<0,3 — антитела не обнаружены (результат отрицательный).

ИФА ZETECT
≥0,3 — антитела обнаружены (результат положительный),
<0,3 — антитела не обнаружены (результат отрицательный).

РМН:
≥1,0 log2 — антитела обнаружены (результат положительный),
<1,0 log2 — антитела не обнаружены (результат отрицательный);

Представленные в табл. 2 данные свидетельствуют, что из 20 исследованных, 17 проб были положительны в ИФА IDEXX, и 19 проб в ИФА ZETECT (85–95% соответственно). Выявленные серонегативные пробы не совпадали. В РМН положительных проб было 15 (75%), три из серонегативных пробы соотносились с отрицательными пробами одного из ИФА теста.

Поскольку не было получено значительной достоверной зависимости в результатах между ИФА реакциями и РМН, дальнейшее тестирование сывороток проводили только в ИФА.

Результаты исследования сыворотки крови свиней №3

№ п/п IDEXX (SP/±) ZETECT (SP/±) № п/п IDEXX (SP/±) ZETECT(SP/±)
1. 0,41 + 0,4 + 2. 0,36 - 1,54 +
3. 0,01 - 0,26 - 4. 1,46 + 0,43 +
5. 0,02 - 0,88 + 6. 3,32 + 0,71 +
7. 0,02 - 0,31 + 8. 1,15 + 1,62 +
9. 0,03 - 0,22 - 10. 1,29 + 0,99 +
11. 0,04 - 1,6 + 12. 1,62 + 1,61 +
13. 0,27 - 0,09 - 14. 2,79 + 0,22 -
15. 0,53 + 0,34 + 16. 4,08 + 0,73 +
17. 0,02 - 0,22 - 18. 2,82 + 1,27 +
19. 3,5 + 1,73 + 20. 0,38 - 0,29 -
21. 1,27 + 0,2 - 22. 2,52 + 1,91 +
23. 0,13 - 0,16 - 24. 1,28 + 1,26 +
25. 0,11 - 0,39 + 26. 1,68 + 0,77 +
27. 0,42 + 0,46 + 28. 3,47 + 0,81 +
29. 3,32 + 1,73 + 30. 2,36 + 0,55 +
31. 0,12 - 0,26 - 32. 0,21 - 0,21 -
33. 0,15 - 0,1 - 34. 3,51 + 0,69 +
35. 0,04 - 0,12 - 36. 2,21 + 0,84 +
37. 0,01 - 0,12 - 38. 2,74 + 1,23 +
39. 0,05 - 0,11 - 40. 2,24 + 0,36 +
41. 1,26 + 0,52 + 42. 1,96 + 1,69 +
43. 2,32 + 0,77 + 44. 0,41 + 0,61 +
45. 0,06 - 0,35 + 46. 0,41 + 0,52 +
47. 1,34 + 0,59 + 48. 0,72 + 1,03 +
49. 3,12 + 0,41 + 50. 2,28 + 0,25 -
51. 4,93 + 0,66 + 52. 3,21 + 0,14 -
53. 1,12 + 1,54 + 54. 0,43 + 0,35 +
55. 2,54 + 1,51 + 56. 0,12 - 0,16 -
57. 2,32 + 0,49 + 58. 1,85 + 0,34 +
59. 2,01 + 0,72 + 60. 2,95 + 0,16 -
61. 1,28 + 1,86 + 62. 2,52 + 1,34 +
63. 2,72 + 0,81 + 64. 1,78 + 0,36 +
65. 2,82 + 0,97 + 66. 2,14 + 1,05 +
67. 4,21 + 1,09 + 68. 3,18 + 1,53 +
69. 2,26 + 1,02 + 70. 2,86 + 0,77 +
71. 1,46 + 1,85 + 72. 0,68 + 0,66 +
73. 1,11 + 0,96 + 74. 3,11 + 0,79 +
75. 1,44 + 0,92 + 76. 3,42 + 1,1 +
77. 1,51 + 0,77 + 78. 0,45 + 0,96 +
79. 2,21 + 0,87 + 80. 1,28 + 0,53 +
81. 1,96 + 0,91 + 82. 2,68 + 1,38 +
83. 2,72 + 0,83 + 84. 1,86 + 1,21 +
85. 3,43 + 0,62 + 86. 2,59 + 0,31 +
87. 2,51 + 1,78 + 88. 3,94 + 1,06 +
89. 4,95 + 1,8 + 90. 2,26 + 0,99 +
91. 1,3 + 0,94 + 92. 1,37 + 0,74 +
93. 1,96 + 1,99 + 94. 3,77 + 0,89 +
95. 1,02 + 0,71 + 96. 3,22 + 1,48 +
97. 0,41 + 0,67 + 98. 2,54 + 1,06 +
99. 0,36 - 0,38 + 100. 0,06 - 0,84 +
101. 2,65 + 0,43 + 102. 0,09 - 0,43 +
103. 0,17 - 0,41 + 104. 0,01 - 0,36 +
105. 0,32 - 1,49 + 106. 0,12 - 0,24 -
107. 2,61 + 0,35 + 108. 0,06 - 0,81 +
109. 1,14 + 0,47 +        

ИФА IDEXX
≥0,4 — антитела обнаружены (результат положительный),
<0,3 — антитела не обнаружены (результат отрицательный).

ИФА ZETECT
≥0,3 — антитела обнаружены (результат положительный),
<0,3 — антитела не обнаружены (результат отрицательный).

Как видно из табл. 3, из 109 исследованных, 82 пробы были положительны в ИФА IDEXX, и 90 проб в ИФА Ingenasa (75–83% соответственно). Выявленные в ИФА Ingenasa серонегативные пробы большей частью совпадали с отрицательными пробами из другого теста.

Результаты исследований всех 149 проб в двух сравниваемых ИФА наборах были попарно переведены в двоичную систему счислений и произведен подсчет коэффициента корреляции. Он оказался относительно невысоким, r=0,49.

Заключение

Результаты исследований сывороток крови от свиней из 3 хозяйств указывают, что большая часть проб имеет специфические антитела к вирусу РРСС. Процент сероположительных проб несколько отличался в разных хозяйствах. В самой большой выборке № 3 было от 75 до 83% (в разных ИФА наборах соответственно) сероположительных животных. Сыворотки из № 1 и № 2 имели от 85 до 95% положительных результатов. Однако при исследовании проб из двух последних хозяйств в РМН число сероположительных было ниже (65 и 75% соответственно). Следовательно, все сыворотки были получены от привитых/инфицированных свиней. Групповая однородность всех трех хозяйств (по проценту сероположительных проб) указывает на достаточную защиту от заболевания.

Относительно невысокое совпадение результатов трех сравниваемых в испытаниях реакций обусловлено сложностями серологических исследований по обнаружению антител к ВРРСС, равно как и особенностями связанными с выявлением в разных реакциях/наборах отличных антител (вируснейтрализующие в РМН, специфические в ИФА и др.). 

Диагностический набор ZETECT PRRS, BIONOTE удобен для практического применения даже в небольших лабораториях, с успехом может применяться для скрининговых исследований по выявлению инфицирования стада ВРРСС, косвенной оценке эффективности проводимой вакцинации и др.

Ваш регион?

Федеральный округ:

Центральный ФО
Приволжский ФО
Сибирский ФО
Южный ФО
Северо-Западный ФО
Дальневосточный ФО
Крымский ФО
Северо-Кавказский ФО
Уральский ФО
Белгородская область
Брянская область
Владимирская область
Воронежская область
Ивановская область
Калужская область
Костромская область
Курская область
Липецкая область
Московская область
Орловская область
Рязанская область
Смоленская область
Тамбовская область
Тверская область
Тульская область
Ярославская область
Москва
Республика Башкортостан
Республика Марий Эл
Республика Мордовия
Республика Татарстан
Удмуртская Республика
Чувашская Республика
Кировская область
Нижегородская область
Оренбургская область
Пензенская область
Ульяновская область
Самарская область
Саратовская область
Пермский край
Республика Алтай
Республика Бурятия
Республика Тыва
Республика Хакасия
Алтайский край
Забайкальский край
Красноярский край
Иркутская область
Кемеровская область
Новосибирская область
Омская область
Томская область
Республика Адыгея
Республика Калмыкия
Краснодарский край
Астраханская область
Волгоградская область
Ростовская область
Республика Карелия
Республика Коми
Архангельская область
Вологодская область
Калининградская область
Ленинградская область
Мурманская область
Новгородская область
Псковская область
Город федерального значения Санкт-Петербург
Ненецкий автономный округ
Республика Саха (Якутия)
Камчатский край
Приморский край
Хабаровский край
Амурская область
Магаданская область
Сахалинская область
Еврейская автономная область
Чукотский автономный округ
Республика Крым
Город федерального значения Севастополь
Республика Дагестан
Республика Ингушетия
Кабардино-Балкарская Республика
Карачаево-Черкесская Республика
Республика Северная Осетия
Чеченская республика
Ставропольский край
Курганская область
Свердловская область
Тюменская область
Челябинская область
Ханты-Мансийский автономный округ — Югра
Ямало-Ненецкий автономный округ
Яндекс.Метрика